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钼固氮酶还原二氮过程中动态金属因子的结构证据

固氮酶是一种生物催化剂,可以在一系列复杂的金属因子存在下将二氮(N2)还原为氨。但是,反应的机理细节仍然很少。在《科学》杂志的最新报告中,Wonchull Kang和美国加利福尼亚大学欧文分校的化学,分子生物学和生物化学研究团队报告了一种含氮酶钼铁(MoFe)蛋白的1.83埃晶体结构。在生理二氮转化条件下捕获。研究结果可以评估N 2的可能机制 减少过程中带状硫的位置及其作用。

在大气中将大气中的二氮(N 2)还原为可生物利用的氨(NH 3)的过程中,氮酶是全球氮循环中关键步骤的催化剂。钼固氮酶包含两种蛋白质成分:一种包含铁硫(Fe 4 S 4)中的铁(Fe)蛋白。在每个亚基内均带有一个三磷酸腺苷(ATP)结合位点的簇。含有其他的,钼铁(钼铁)蛋白α 2 β 2异四聚体与两个复metalloclusters。在钼氮化酶(Mo-nitrogenase)催化过程中,两个蛋白质成分之间的重复缔合和解离使得ATP依赖性电子从Fe 4 S 4簇转移到MoFe蛋白质上,从而减少了底物。固氮酶能够将许多电子传递到它的辅助因子上,使该酶在底物还原过程中具有很高的通用性。

了解固氮酶的作用机理

自从发现固氮酶以来,人们进行了许多努力来了解其机理,其中一些研究集中在酶的底物和抑制剂相互作用上。在这些努力中,Kang等。通过限制无意中推动N 2还原过程向前发展的过量电子供应,确定了值得考虑的策略。这将酶的底物或中间结合状态还原为静止状态或将酶还原为不可识别的混合状态。该过程是相关的,因为在过量的连二亚硫酸盐作为外部供应的还原剂存在下常规分离了固氮酶蛋白质,并且在没有氧气的情况下去除该人工电子源可以帮助科学家捕获二氮(N 2)或其中间体进行分析。

作为概念的证明,Kang等。制备好氧细菌菌株Azotobacter vinelandii的粗提物,在细胞破裂后添加或不添加连二亚硫酸盐。在两种情况下,葡萄曲霉菌株均主动表达含有组氨酸标记的 MoFe蛋白的Mo-氮酶。当他们分析这些样品的活性时,由于减少了细胞提取过程中粗提取物中电子的消耗,不含连二亚硫酸盐的粗提取物样品在底物还原过程中几乎没有活性。Kang等。因此可以通过添加连二亚硫酸盐和ATP(即通过提供电子)完全恢复样品的活性。

固氮酶簇-两个独特的金属簇:P簇和M簇。

基于概述的条件,当主动进行N 2固定的表达固氮酶的培养物在没有其他电子供给的情况下进行细胞裂解时,固氮酶仍保持功能。尽管由于电子流撤回到位于固氮酶内的铁-硫金属簇(称为M簇)而可能以“休眠”或中间结合状态被阻止。当康等。如果纯化出不含连二亚硫酸盐的粗提物,带有组氨酸标签的MoFe蛋白(在研究中称为AV1 *)在N 2还原过程中具有活性,并且也具有完整的功能。当研究小组将AV1 *结晶时,他们观察到了棕色晶体,衍射后的分辨率为1.83埃。他们确认了使用异常密度数据并使用电子顺磁共振观察两个 AV1 *的P团,观察结构分配。结果为他们提供了对这种实验状态的生理相关性的长期寻求的答案,并指出了在没有连二亚硫酸盐的情况下,该化合物的两个独特金属簇(P和M簇)之间电子的流动受限。

与实验观察结果一致的可能的作用机理包括逐步减少二氮(N 2)基于M簇的旋转,在固氮酶催化剂上的三个带硫位点处。提出的机理始于在特定位点N 2的紧密结合,然后将结合的N 2旋转至另一个随后的位点(在化合物上被标为S3A至S2B至S5A的位点)。在此过程中,还原/ N为质子化2到二氮烯水平通过氢键发生,随后是将其转化为进一步减少/质子化氨从该结构的释放之前,。随后簇的旋转将新的N 2分子带到下一个位置,以启动下一轮逐步的N 2在催化过程中,通过精细机理中的连续团簇旋转而减少还原。这种在不同反应位点之间的循环大致类似于ATP合酶的机制。因此,旋转的金属簇通过分治法有效地实现了N 2的多电子还原。

为了了解在有限的电子通量下AV1 *的硫置换构象,研究小组与连二亚硫酸盐(称为AV1 * TOD)形成了AV1 *转换,产生了棕色晶体,衍射后的分辨率为1.73Å。观察结果与化合物上结合的二氮物种的机理一致,并说明了催化过程中构象的生理相关性。用双氮物质置换三个不同位点的能力与先前的研究一致依赖于催化的硒。Kang等。他提出了许多机制来解释这些观察结果,但是他们寻求进一步的实验支持来验证它们。该小组强调,由于化合物中存在不对称的带硫位移,所有带硫位点都可能参与催化过程。该结果旨在激发固氮酶活性机理的范式转变,最终了解该酶的复杂机理。

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