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CRISPR-Cas转染的神经元中的单细胞基因分型

与使用CRISPR-Cas进行基因组编辑一样强大,该技术存在局限性。其中之一就是确定单个CRISPR-Cas转染细胞的基因型的能力。现在,来自马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所(MPFI)的研究小组开发了一种在CRISPR-Cas转染的神经元中进行单细胞基因分型的策略,并表明它们可以识别体内表型的遗传原因。

这项工作发表在“ 细胞报告 ”中的“ 用CRISPR / Cas9转染的小鼠皮质神经元的体内单细胞基因分型 ”中。

“基于CRISPR / Cas9的基因靶向技术有望系统地理解神经回路的组装,功能和功能障碍的分子基础,”抑制性神经发育与功能研究组组长Hiroki Taniguchi博士指出。 MPFI的电路组。“通过我们的单细胞测序确定的基因型与通过表型评估推导的基因型之间的完美匹配,表明我们的方法是一种强大的新方法,能够增强可靠性并扩展基于CRISPR的技术的应用。”

Steinecke等人的图形摘要。

作者解释说,非同源末端连接(NHEJ)“随机产生不同类型的突变,如缺失,取代和插入,这可能导致基因突变,功能丧失和功能获得等位基因。”最重要的是,CRISPR-Cas转染细胞中的突变可能以单等位基因或双等位基因的方式发生。

“由于NHEJ,尽管CRISPR可以精确地靶向目标基因,但其作用可能高度可变,” MPFI研究员,该出版物的第一作者Andre Steinecke博士解释说。“ CRISPR可以使细胞带有完全无功能的基因,弱化的基因,甚至有时甚至增强其功能。” Steinecke断言:“当去除对细胞产生明显影响的细胞时,这并不是问题,因为您可以轻松地观察到变化并且缺少该基因编码的蛋白质。但是有些,尤其是大脑中的基因,没有明显的作用或很难想象。”

该小组的目标是创建一种广泛应用的策略,能够可靠地确定确切的遗传原因并将其与观察到的表型相关联。为此,他们将激光显微切割技术与单细胞基因分型相结合,设计了一个实验管线,能够研究CRISPR介导的细胞效应,同时准确确定引起它们的确切DNA变化。

研究人员表明,皮层切片的切片和随后的激光显微切割使它们能够分离出单个CRISPR-Cas转染的神经元。在单个参考神经元中包含CRISPR-Cas靶向基因组区域的PCR产物的测序提供了与从其靶蛋白表达和表型推导的基因型完全一致的基因型,从而建立了一种强有力的策略来确定CRISPR-Cas转染的神经元的基因型和表型之间的因果关系。

为了验证他们的策略,MPFI的团队设计了CRISPR技术,将金字塔神经元中的一种基因编码为关键结构蛋白,称为Ankyrin-G(AnkG)。通常,AnkG蛋白被限制在神经元的特定区域,即轴突初始节(AIS),负责产生动作电位。去除AnkG后,AIS会发生明显的增厚,可以使用显微镜进行检测。有了这个特征,可以容易地区分出缺少AnkG的神经元,然后可以确定它们的确切基因型。他们发现,以CRISPR探针转染的神经元主要表现出AnkG缺失以及AIS明显增厚。但是一小部分被CRISPR转染的神经元仍然表现出与野生型神经元相当的AnkG水平和AIS厚度。证明了CRISPR对不同细胞的不同作用。

为了探测和确认潜在的遗传原因,研究小组随后使用激光显微解剖法分离并提取了已经表征了表型的单个神经元。提取后,研究小组分别对每个单个细胞进行测序,以确定基因型。他们发现,他们的策略可以可靠且可重复地将观察到的表型与基因型联系起来,其中缺乏AnkG且轴突增厚的神经元在该基因的两个拷贝中均显示功能丧失突变,而AnkG正常水平的神经元则仅在一个拷贝中显示突变( CRISPR或正常基因型(对照神经元)转染的神经元。然后,研究小组使用另外两个基因MeCP2和Satb2确认了他们的策略,发现他们的过程可以再次有效地将观察到的特征与潜在遗传相关。

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