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研究人员开发了一个基于CRISPR的可转移和集成的I型平台来编辑超级细菌

由理学院分子与细胞生物学研究部副教授严爱新博士领导的研究团队,与李嘉诚医学院微生物学系荣誉临床教授胡振宇合作香港 (HKU) 报告了一个可转移和综合的 I 型 CRISPR 平台的开发,该平台可以有效地编辑铜绿假单胞菌的不同临床分离株,铜绿假单胞菌是一种能够感染各种组织和器官的超级细菌,也是医院感染的主要来源。

该技术可以加速多重耐药 (MDR) 病原体耐药决定因素的识别和新型抗耐药策略的开发。

该研究开辟了一条新的途径来对那些野生细菌物种和分离株进行基因组编辑,例如具有临床和环境意义的那些以及形成人类微生物组的那些。它还提供了一个框架来利用原核基因组中广泛存在的其他 CRISPR-Cas 系统并扩展基于 CRISPR 的工具包。该研究已发表在领先的科学期刊Nucleic Acids Research 上。

背景

CRISPR-Cas 系统包含原核生物中的适应性免疫系统,它通过切割病毒的 DNA 来解除入侵病毒的武装。由于其独特的靶向和改变 DNA 序列的能力,CRISPR-Cas 已被用作下一代基因组编辑方法。

该方法基于 2 类 II 型 CRISPR/Cas9 系统,该系统彻底改变了大量生物的遗传学和生物医学研究,并获得了 2020 年诺贝尔化学奖。然而,第 2 类 CRISPR-Cas 系统仅占原核生物中自然编码的 CRISPR-Cas 系统的约 10%。它们在编辑细菌基因组方面的应用相当有限。

值得注意的是,属于不同类别和类型的 CRISPR-Cas 系统不断被识别,它们作为扩展基于 CRISPR 的工具包的深水库。最多样化和分布最广的 CRISPR-Cas 系统是 I 型系统,它占已识别的所有 CRISPR-Cas 系统的 50%,并有可能扩展基于 CRISPR 的工具包,并具有 2 类系统无法获得的独特优势高特异性、最小的脱靶和大片段缺失能力。

然而,I 型 CRISPR-Cas 系统依赖于称为 Cascade 的多组分效应复合物来干扰 DNA,该 DNA 不易转移到异源宿主,阻碍了这些天然丰富的 CRISPR 在基因组编辑和治疗中的广泛应用。

此前,该团队在从玛丽医院血流感染病例中分离出的临床多药耐药铜绿假单胞菌菌株PA154197中鉴定出高活性型IF CRISPR-Cas系统。他们对该 CRISPR-Cas 系统进行了表征,并基于该天然型 IF CRISPR-Cas 系统成功开发了一种适用于 MDR 分离株的基因组编辑方法。该方法能够快速识别 MDR 临床分离株的耐药性决定因素并开发新的抗耐药性策略 ( Cell Reports , 2019, 29, 1707-1717)。

为了克服将复杂的 I 型 Cascade 转移到异源宿主的障碍,在这项研究中,该团队将整个 IF 型cas操纵子克隆到集成熟练的载体 mini-CTX 中,并通过接合将盒式传递到异源宿主中自然界中常见的。mini-CTX 载体能够将整个 Cascade 整合到异源宿主基因组中保守的attB基因位点上,使它们能够拥有一个可以稳定表达和发挥功能的“天然”型 IF CRISPR-Cas 系统。

该团队表明,与可转移 Cas9 系统相比,转移型 IF Cascade 显示出显着更大的 DNA 干扰能力和更高的应变稳定性,可用于高效 (>80%) 和简单的基因组编辑,即通过一步转化单个编辑质粒。

此外,他们开发了一种先进的可转移系统,包括高活性型 IF 级联和重组酶,以促进该系统在同源重组能力较差的菌株、没有基因组序列信息的野生铜绿假单胞菌分离株和其他假单胞菌中的应用物种。

最后,引入的 IF 级联基因可以通过 IF 级联介导的大 DNA 片段删除从宿主基因组中轻松去除,从而在宿主细胞中进行无疤痕基因组编辑。还展示了可转移系统在基因抑制中的应用,突出了开发的可转移型 IF CRISPR 系统的强大和多样化的应用。

严爱新博士预测,这种新方法将扩展到编辑病原体和微生物组以促进人类健康。

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