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在DNA重组过程中解开D环的神秘面纱

同源重组是DNA修复的一种机制,可以在DNA分子之间交换遗传信息。结构分析揭示了蛋白质RecA如何协调这个过程。我们的染色体进行DNA损伤剂,可导致基因组完整性的丧失的恒定堰坝1,2。同源重组是DNA修复的进化上保守的类型,它可以固定损害的特别危险形式,其中DNA分子断裂的两条链3,4。同源重组的关键需求反映在癌症和易患癌症的综合征中,这些综合征与蛋白质的缺陷有关,例如在重组中起作用的蛋白质BRCA1和BRCA2 5。Yang等人在《自然》中写作。6报告的结构数据揭示了蛋白质RecA如何促进细菌同源重组过程中的关键早期步骤。

在同源重组过程中(图1a),双链断裂位点的DNA经历了一个酶促加工步骤,该过程会产生称为突触前单链DNA的单链突出端。此突触前DNA然后“侵入”双链DNA分子的一个相同的部分(称为同源DNA)和对与所述匹配互补链,其结果在该双链DNA的未互补链的位移3,4。这种配对事件被称为链交换,和它产生的DNA构造被称为位移环路(d-循环),这是所需要的事件的基本中间结构铅DNA修复3,4。Yang及其同事提供了D环结构的详细数据,这些数据为同源重组的机理提供了新见解。

RecA的羧基末端结构域(CTD)结合。然后将其进一步向内引导至细丝的中心,并分离其DNA的两条链。互补链与RecA的初级DNA结合位点(具有三个成对的核苷酸)中的突触前DNA配对,非互补链与RecA的次级DNA结合位点(与五个未成对的核苷酸结合)结合。当DNA序列在主要位点中匹配时,双链DNA的链分离继续,并且D-环生长在对应于突触前DNA的3'至5'方向的方向上发生。

重组过程中发生的复杂DNA交易是由RecA重组酶家族成员介导的。在此过程中,RecA蛋白在突触前的单链DNA上形成长丝。然后,与RecA结合的DNA侵入双链DNA分子,并将两条链分开。然后确定该开放的DNA是否与RecA包被的DNA的序列匹配。这个过程必须非常迅速地进行,因为可能需要对许多双链DNA序列进行采样,直到找到正确的匹配为止。

由RecA酶形成的细丝相对于其正常长度7将突触前单链DNA拉伸约50%。但是,DNA不能均匀拉伸。结合在所谓的RecA初级DNA结合位点内的DNA被组织成三倍的核苷酸碱基(每个RecA分子一个三联体),保留了正常双链DNA的尺寸。但是,这些三元组之间的DNA主链(糖和磷酸基团的链)与它的通常形式相比大大延长7,8。

当互补DNA链与RecA包覆的突触前单链DNA配对时,它也采用这种延伸的构象,并主要通过与突触前DNA的碱基配对相互作用而稳定下来。这提供了一种鉴定具有正确核苷酸配对相互作用7的序列匹配的方法。但是,此过程的许多方面仍不清楚。特别是,缺少关于结合RecA的DNA如何首先与双链DNA分子相互作用,然后打开链以形成D环的结构信息。

杨等。使用高分辨率的低温电子显微镜观察D环中间体的结构。RecA的结构研究非常困难,因为RecA可以形成与DNA结合的不同长度的细丝。为了克服这个问题,作者将九种RecA蛋白融合在一起,并对该“微丝”末端的氨基酸残基进行了突变,以防止RecA分子的进一步添加。这些简短,定义明确的RecA细丝的使用使作者能够发现一些有关重组过程的关键缺失信息。他们的发现阐明了RecA介导D环形成时发生的蛋白质与DNA相互作用的编排。

结构数据表明,在该过程开始时(图1b),RecA的羧基末端结构域(CTD)区域与双链DNA结合并引导其朝向RecA中心附近的主要DNA结合位点结合的DNA细丝。那里的一个小蛋白质环有助于打开双链DNA。一旦打开,置换的非互补链将沿着RecA–DNA细丝表面的一个区域结合,称为第二DNA结合位点。已知该位点存在,但尚未完全确定其在蛋白质表面上的位置。未置换的互补DNA链的定位方式使其能够与突触前的单链DNA配对。

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然后,相对于突触前DNA的方向,双链DNA的连续打开优先在3'至5'方向进行。但是,如果新相互作用的链不匹配,则在每个连续的RecA蛋白上进一步打开双链DNA的可能性将大大降低。当相互作用的链匹配时,D-环继续延伸。在这种情况下,通过置换链与次级DNA结合位点的结合以及互补链与突触前单链DNA之间的碱基配对相互作用,可以进一步稳定结构。

Yang及其同事还发现,此过程具有令人惊讶的功能-一级DNA结合位点和二级DNA结合位点之间的DNA相互作用之间存在不对称性。拉伸的单链DNA的三个核苷酸与一级位点上的每个RecA蛋白结合,而每个RecA蛋白质在其二级位点上与DNA的五个核苷酸结合。

这种结合不对称的功能目的是未知的。一个可能的好处是使互补的单链DNA具有一定的灵活性,这样,如果其中五个碱基解开(而不是三个碱基),则原则上可以将未解链的单链DNA置于三个碱基中。主要结合位点中的不同寄存器,以测试与突触前DNA的不同碱基配对相互作用。这可能有助于确保在初级DNA结合位点中快速形成最佳碱基配对相互作用。此外,一旦找到正确的序列匹配,结合不对称性可能会通过进一步开放足够的双链DNA来帮助建立与长丝中下一个RecA蛋白相关的碱基配对,从而有助于传播链入侵。

即使有了Yang及其同事的工作所提供的非凡见解,仍然存在许多关键问题。与突触前DNA链不匹配的非同源序列要多久才能被检测和剔除?非同源序列远远超过同源序列,如果花费太多时间对错误序列进行采样,同源重组将无法成功。要进行稳定的配对相互作用,核苷酸序列之间需要有多少互补性?当序列不完全匹配时会发生什么?了解这些相互作用的确切性质可以揭示确定序列是否足够同源以支持RecA介导的重组的原因。

在真核生物(在其细胞中具有核的生物)中发现的RecA版本称为Rad51。在真核生物中理解重组将需要通过也涉及重组其它辅助蛋白所使用的结构和机制的判定,因为的Rad51是高度依赖于这样的蛋白辅因子9,10。低温电子显微镜作为一种用于定义复杂重组中间体的高分辨率结构的工具的出现,为解决这些以及许多有关同源重组的有趣难题提供了潜力。

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